样品制备质量直接影响显微镜成像效果，但固定失效、切片褶皱、染色不均等问题频发。本文系统梳理10大典型问题，结合显微图像案例，提供可落地的解决方案。
一、固定失效：组织自溶与抗原流失
问题表现：细胞形态模糊、结构松散
解决方案：
固定液选择：
常规组织：4%多聚甲醛（4℃保存）
膜蛋白保护：添加0.1% Triton X-100
固定时间：
薄切片（<1mm）：2-4小时
整块组织：12-24小时（需真空渗透）
验证方法：
切片后行H&E预染色，观察核质分界清晰度
二、切片问题：厚薄不均/褶皱/破裂
问题表现：切片卷曲、厚度超标（>5μm）
解决方案：
刀片维护：
玻璃刀：用酒精灯灼烧去除组织残渣
一次性刀片：每20次更换新刀片
防卷板技巧：
调整防卷板角度至15-20°
涂抹薄层甘油（降低静电吸附）
切片方向：
纤维组织：平行于纤维走向切片
血管组织：垂直于血流方向切片
三、染色不当：对比度不足/过染
问题表现：细胞核染色过浅/细胞质染色溢出
解决方案：
苏木素染色：
初染时间：3-5分钟（室温）
分化液控制：盐酸酒精分化至粉红色即止
伊红染色：
浓度选择：0.5-1%伊红Y水溶液
染色时间：1-3秒（镜下观察控制）
特殊染色：
脂质染色：苏丹Ⅲ需用70%酒精分化
黏液染色：阿尔辛蓝需pH2.5环境
四、脱水不彻底：封片后产生气泡
问题表现：切片出现彩虹状气泡
解决方案：
梯度脱水：
酒精梯度：70%→80%→95%→****（每级5分钟）
叔丁醇替代：用于对酒精敏感样本
干燥验证：
二甲苯透明后，用滤纸测试无湿润痕迹
封片技巧：
中性树胶需预热至40℃（降低黏度）
盖玻片倾斜45°缓慢放下
五、样品污染：真菌/细菌滋生
问题表现：切片出现絮状沉淀物
解决方案：
预防措施：
固定液添加0.01%叠氮化钠
切片刀用75%酒精擦拭消毒
应急处理：
污染切片：重新脱水至70%酒精后浸泡于1%氢氧化钠24小时
严重污染样本：废弃处理并消毒器械
结语
样品制备是显微镜观察的基础环节，需建立标准化操作流程（SOP），关键步骤设置质量控制点。建议每月进行制备成功率统计，定期参加技术培训班。掌握这些核心技能，您将显著提升制片合格率与成像质量。
