光学显微镜的相差观察方法（Phase Contrast）是一种利用光的干涉原理来增强样品与背景之间对比度的观察技术。以下是对光学显微镜相差法观察方法的详细介绍：
一、成像原理
人眼只能在光波的波长（颜色）和振幅（亮度）有变化的情况下区分被检物体。对于和周围介质折射率相差不大的透明状物体，如活细胞、微生物等，光线通过时波长和振幅变化不显著，难以分辨。相差观察方法利用样品的厚度和折射率引起的相位差，通过光学系统的转换，将这个相位差转换成振幅差（即亮度差），从而提高样品的可见度和对比度。
具体来说，当光线通过样品时，由于样品不同部分的折射率不同，光线会发生不同程度的折射和相位延迟。这些相位差异在通过相差物镜和相差聚光镜时，会被转换成振幅差异，使得样品的不同部分在视野中呈现出不同的亮度，从而提高了样品的清晰度和可见度。
二、关键部件
相差观察方法需要以下关键部件：
相差聚光镜：在光源与聚光镜之间加入相差环（环形光阑），使透过聚光镜的光线形成环形光。相差环的环状孔直径和孔宽与物镜内的相位环板匹配，形成的像恰好落在物镜后焦面与相位板上的共轭面重合。因此，不同倍数物镜要与不同倍数的环匹配。相差环可通过推拉环板、转盘聚光镜等形式切换进出光路。
相差物镜：相差物镜镜片中装有相位板，这个相位板通常由氟化镁等材料制成，能够将直射光或衍射光的相位推迟1/4波长。根据相位板的不同设计，相差可以分为正相差和负相差两种类型。正相差物镜标记为Ph，背景变暗，样品边界外围形成白色光环；负相差物镜标记为Nh，背景非常暗，样品边界内围形成白色光环。
三、操作步骤
准备样品：将待观察的样品放置在载物台上，并用压片夹固定好。
对光：打开显微镜的电源开关，调节光源和聚光镜，使光线形成环形光照明。
放置相差物镜：将相差物镜安装在物镜转换器上，并旋转到工作状态。
调节焦距：使用粗调和细调螺旋调节焦距，使样品在视野中清晰可见。
观察：通过目镜观察样品，并调整光源强度和光圈大小以获得Z佳的观察效果。
四、注意事项
选择合适物镜和聚光镜：不同倍数的物镜需要配合相应倍数的相差聚光镜使用，以确保获得Z佳的相差效果。
保持样品清洁：样品表面B须清洁无尘，否则会影响观察效果。
调节光源强度：光源强度应适中，过强或过弱都会影响观察效果。
对中调节：相差环附近通常有对中螺丝，用于对中相差环。未调中的相差环会导致相差效果大打折扣。对中望远镜（合轴调节望远镜）可用于调中相衬环。
五、应用
相差观察方法在生物学、医学、材料科学等领域都有广泛的应用，特别是在细胞生物学和微生物学研究中。相差显微镜能够清晰地观察到活细胞、微生物等无色透明样品的形态和结构，为科学研究提供了有力的支持。
综上所述，光学显微镜的相差观察方法是一种利用光的干涉原理来增强样品与背景之间对比度的观察技术。通过合理配置和使用相差聚光镜和相差物镜等关键部件，并遵循正确的操作步骤和注意事项，可以获得高质量的相差图像。
